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慢病毒包裝

 更新時間:2020-03-19 點擊量:1579

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。所以,在體外實驗及體內(nèi)實驗的研究中,慢病毒己經(jīng)成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一, 并且正在獲得越來越廣泛的應用。

 

慢病毒(Lentivirus) 載體

 

      在細胞實驗中,對于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚無法轉(zhuǎn)染的細胞,通過使用病毒介導的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導效率,達到目的基因高效表達的目的。

 

       具體來說,慢病毒包裝主要應用于以下幾個方面:

       1、對于難轉(zhuǎn)染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,極大地方便了RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究;

       2、進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選;

       3、為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液;

 

慢病毒包裝應用

  

       為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,通常需要利用慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,在細胞中進行病毒的包裝。慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞后,在細胞漿中被其自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA,形成DNA整合前復合體,進入細胞核后,DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,回到細胞漿中,表達目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。

 

慢病毒表達載體

 

 

       慢病毒包裝實驗方法

 

 

 

 

 

        1.構(gòu)建含有目的基因的慢病毒表達載體

        2.細胞準備:細胞傳代后,密度達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染;

        3.轉(zhuǎn)染復合物制備:取兩個EP管,一個(A管)加入慢病毒載體的表達質(zhì)粒、混合包裝質(zhì)粒和Opti-MEMI;另一個(B管)加入Opti-MEMI、轉(zhuǎn)染試劑,一邊輕柔渦旋A管,一邊往A管滴加B管的溶液。溶液混合后,室溫放置10-25分鐘,即完成轉(zhuǎn)染復合物的制備。

        4.細胞轉(zhuǎn)染:將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中,混勻后孵育;

        5.收集病毒:轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清;

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